Эффективность нового гемостатического средства «Фибриностат» в опытах IN VITRO и IN VIVO

1 Бордаков В.Н.1, Доронин М.В.1, Расюк Е.Д.2 Эффективность нового гемостатического средства «Фибриностат» в опытах IN VITRO и IN VIVO 1Государственное учреждение «432 главный военный клинический медицинский центр Вооруженных Сил Республики Беларусь» г. Минск 2Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии» г. Минск Проблема эффективного местного гемостаза при паренхиматозных кровотечениях является чрезвычайно актуальной [7]. Весьма сложным является осуществление гемостаза при хирургических вмешательствах на паренхиматозных органах, их травматическом повреждении, особенно при нарушениях в системе гемостаза. В нашей стране отсутствует промышленное производство местных гемостатиков, удовлетворяющих потребности практического здравоохранения. Существующие же импортные препараты малодоступны из-за их дороговизны. Отдельной строкой следует очертить эту проблему для военно-полевой хирургии, а также чрезвычайных ситуаций военного и мирного времени [ 4-8]. Нарушения гемостаза при различных состояниях и заболеваниях организма (травмы, оперативные вмешательства, род-ы, болезни крови, печени, гемморрагические диатезы, ДВС- синдроме) могут быть обусловлены изолированным или совместным расстройством сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного механизмов остановки кровотечений. В зависимости от поражения того или иного компонента системы гемостаза (или их различного сочетания), клиническая картина гемморрагических проявлений и тактика врача в борьбе с кровоточивостью будут разными [1-3, 9-11]. В настоящее время в арсенале гемостатических средств имеются препараты местного действия сухая плазма, тромбин, гемостатическая губка и др. Однако их применение не всегда оказывает гемостатический эффект необходимой силы, а в некоторых случаях чревато возникновением вторичного кровоте-чения. Одной из причин этого является то, что известные препараты для местного применения в своем большинстве обладают слабовыраженным и непродолжительным целевым действием. Кроме того, применение порошкообразных и аппликационных препаратов из донорской плазмы при профузных паренхиматозных кровотечениях по ряду причин малоперспективно, как в плане оказания специфических лечебных свойств, так и целесообразности их использования в целом, из-за ограниченности проявления гемостатического действия средствами данного класса, смываемого током крови с раневой поверхности [12]. Вышеизложенное определяет необходимость разработки нового гемостатического препарата локального действия, обладающего выраженным гемостатическим эффектом. Таким препаратом является лекарственное средство «Фибриностат», разработаное в лаборатории экспериментальной патологии и трансфузиологии ГУ «РНПЦГТ МЗ РБ» (г. Минск). Новое средство состоит из растворов фибриногена и тромбина. По механизму действия он дублирует конечную стадию естественного каскада свертывания плазмы, которая заключается в образовании из растворимого плазменного белка фибри-ногена фибринового сгустка который останавливает кровотече-ние [9]. 1

2 Эффективность «Фибриностата» заключается в том, что образование сгустка происходит не на поверхности печени, как у других гемостатиков, а уже на выходе, то есть интравазально. Это дает возможность его использования у больных с нарушениями в системе гемостаза. Еще одним преимуществом «Фибриностата» является ускорение регенеративного процесса и послеоперационной эпителизации раневой поверхности [13]. Цель исследования Экспериментальная оценка целевых свойств и фармакодинамики нового гемостатического средства «Фибриностат» при паренхиматозном кровотечении, а так же выявление системных эффектов последействия. Материалы и методы В рамках изучения целевых свойств нового гемостатического средства местного действия был проведен сравнительный анализ коагуляционной активности тромбина и качества фибри-ногена входящих в состав «Фибриностата» и импортного аналога «Тиссукол кит», Baxter (Австрия) в экспериментах in vitro. В эксперименте применялся ручной коагуляционный метод, который проводился на водяной бане и заключался в визуальном определении промежутка времени от добавления стартового реактива (тромбина) до момента выпадения фибрина. Для изучения фармакодинамики и выявления системных эффектов последействия «Фибриностата» использовали 50 беспородных белых крыс обоих полов с массой тела 230±25 г.. Животные были разделены на четыре группы: первая группа животные без каких-либо повреждений и вмешательств («интактный контроль»), вторая группа животные с травмой печени без применения гемостатических средств («контрольная группа»), третья группа животные с травмой печени и применени-ем «Тиссукола» - препарата сравнения - в качестве кровоостанавливающего средства («группа сравнения»), четвертая группа животные с травмой печени и применением композиционного гемостатического средства «Фибриностат» («опытная группа»). Операции во всех случаях проводили под общей анестезией. Крысы вводились в состояние общей анестезии путем инъекции в брюшную полость 0,3 мл реланиума и 0,4 мл калипсола. После верхнесрединной лапаротомии, в рану выводилась левая доля печени. Далее выполняли стандартную клиновидную резекцию в области левой доли печени размером 10 х 5 мм. В контрольной группе животных гемостаз наступал самопроизвольно после прижатия раны марлевым шариком. Животным групп сравнения и опытных серий на кровоточащую поверхность из шприца послойно наносили «Тиссукол» (препарат-аналог) и «Фибриностат», соответственно. После чего края раны сводились и удерживались течение 3-5 мин, в ходе которых они прочно склеивались. Через 15 мин. после остановки кровотечения операционная рана ушивалась наглухо и животные выводились из наркоза. Наблюдение за экспериментальными животными осуществляли в течение семи суток после применения препарата. Через определенные интервалы времени (на первые, третьи и седьмые ) животным производился забор образцов крови путем пункции перикарда для лабораторного исследования. Для получения базовых результатов забор крови, так же производили у 5 животных без нанесения какой либо травмы («интактный контроль»). 2

3 Величину гематокрита, уровень гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и ряд других расчетных параметров клеточного состава крови исследовали с помощью анализаторов крови F-800 «Sysmex» (Япония) и COULTER AC T diff TM (США). Содержание общего белка оценивали по методу связывания с красителем Понсо C (Sigma, США), альбумина по его связыванию с красителем бромкрезоловым зеленым (БКЗ, США). Концентрацию мочевины определяли диацетилмонооксимным методом. Детекцию активности аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) осуществляли колориметрическими методами. Изучение системы вторичного гемостаза осуществляли унифицированными методами, позволяющими охарактеризовать основные фазы свертывающего процесса: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ) и содержание фибриногена (ФГ). Исследование проводилось на анализаторе гемокоагуляции CGL 2110 (ОАО Солар, Беларусь). Результаты и обсуждение 1. Сгусткообразующая активность в опытах in vitro В результате оценки коагуляционной активности тромбина и качества фибриногена, входящих в состав «Фибриностата» и «Тиссукол кит», Baxter (Австрия) in vitro зафиксированы практически идентичные результаты. Плотный сгусток образовывался примерно за одно и то же время 5,8±0,17 и 4,8±0,16 с. соответственно, что свидетельствует о выраженной сгусткообразу-ющей способности «Фибриностата» (таблица 1). Таблица 1. Коагуляционная активность разрабатываемого гемостатического средства «Фибриностата» и аналога «Тиссукол кит», Baxter (Австрия) в экспериментах in vitro Условия эксперимента Раствор фибриногена и апротинина «Фибриностат» Время образования сгустка, с Раствор тромбина 500 МЕ/мл и кальция хлорида («Фибриностат») Раствор тромбина 500 МЕ/мл и кальция хлорида «Тиссукол кит», 5,8±0,17 Сгусток плотный 5,2±0,23 Сгусток плотный Раствор фибриногена и апротинина «Тис-сукол кит», Baxter (Австрия) 5,6±0,21 Сгусток плотный 4,8±0,16 Сгусток плотный Baxter (Австрия) 2. Влияние на клеточный состав крови в опытах in vivo При оценке результатов цитологического исследования «красной» крови установлено, что на 1-е в контрольной группе отмечалось снижение уровня гемоглобина на 18,4%, гематокрита на 16,2%, а также снижение количества эритроцитов на 16,9% по сравнению с интактным контролем. Однако уже к 7-им суткам отмечалась тенденция к восстановлению исследуемых показателей. В группах сравнения и опытной значительных изменений в данных показателях не выявлено 3

4 Анализ параметров состояния «белой» крови у животных всех трех групп не показал значительных изменений количества и популяционного состава лейкоцитов периферической крови, которые сохранялись в пределах условной физиологической нормы на протяжении всего эксперимента. Важное значение в сравнительной оценке эффективности применения «Фибриностата» имеет изучение первичного тромбоцитарного микроциркуляторного компонента гемостаза, в частности такого показателя как количество тромбоцитов. У животных интактного контроля количество тромбоцитов составляло 733±53,7 109/л. При моделировании травмы печени в контрольной и группе сравнения отмечалось снижение количества тромбоцитов на 1-е и 3-е. В опытной группе с применением «Фибриностата» наоборот количество тромбоцитов на протяжении всего исследования было выше чем в интактной группе, однако данные показатели не выходили за пределы условной физиологической нормы (таблица 2). Таблица 2. Динамика изменений клеточного состава крови Условия эксперимента Исследуемый показатель Концентрация гемоглобина (г/л) Уровень гематокрита (%) Количество эритроцитов 1012/л Количество трмбоцитов 109/л интактный контроль (n=5) 37±1,1 125±5,0 6,1-8,6 733±53,7 Контрольная группа (n=15) 1-е 31±0,9 102±3,8 5,9±0,43 665±190,5 3-е 32±1,5 106±5,2 6,2±0,04 689±346,9 7-е 35±1,5 110±5,3 6,3±0,24 932±62,5 Группа сравнения (n=15) 1-е 37±1,7 117±12,1 6,7±0,50 609±93,2 3-е 35±3,2 111±8,9 6,5±0,47 581±60,8 7-е 36±1,9 127,8±10,8 7,0±0,34 668±110,6 Опытная группа (n=15) 1-е 37±0,8 121±4,2 6,6±0,25 832±89,4 3-е 38±0,8 124±2,1 6,8±0,26 787±48,5 7-е 37±1,5 126±6.2 7,2±0,42 860±70,0 Р <0,05 Таким образом, полученные результаты указывают на то, что применение гемостатического средства «Фибриностат» предотвращало развитее анемии и тромбоцитопении у экспери-ментальных животных в раннем послеоперационном периоде. 2. Влияние на состояние свертывающей системы в опытах in vivo При исследовании показателей коагуляционного гемостаза у животных контрольной группы зарегистрировано увеличение АЧТВ до 33,8±2,86 с. и 39,6±0,1 с. на первые и третьи, и снижение содержания фибриногена до 1,5±0,42 г/л на седьмые посттравматического периода, что свидетельствует об угнетении механизмов внутреннего пути коагуляционного каскада и развивающейся коагулопатии потребления. Так же наблюдалось постепенное возрастание ТВ до 4

5 46,5±15,9 с. к седьмым суткам после травмы. Значение ПВ в контрольной группе оставалось в пределах физиологической нормы на протяжении всего наблюдения. В отличии от группы контроля у животных с применением «Тиссукола» и «Фибриностата» значения АЧТВ, ТВ, и уровня содержания фибриногена в крови не изменялись на протяжении всего исследования. Наряду с этим в опытной группе к третьим суткам отмечалось уменьшение ПВ на 45 % по сравнению с интактным контролем, с последующей тенденцией к восстановле-нию до нормальных значений. Данный показатель составил на первые 18,7±3,13 с., на третьи 15,0±0,51 с. и на седьмые - 16,8±1,82 с. Сходная динамика изменений ПВ отмечалась в группе сравнения, что свидетельствует об актива-ции процесса протромбинообразования, поскольку этот тест ха-рактеризует функциональное состояние внешнего пути сверты-вания крови, а также активность факторов протромбинового комплекса (таблица 3). Таблица 3. Динамика изменений коагулограммы Условия Исследуемый показатель эксперимента АЧТВ (с) ПВ (с) ТВ (с) Фибриноген (г/л) Условная физиологическая норма 28,6 23,4 34,2 20,2 35,1 19,1 2,1 3,5 интактный контроль (n=5) 26,0±1,16 27,2±3,52 27,1±3,93 2,8±0,25 Контрольная группа (n=15) 1-е 33,8±2,86 24,8±1,36 36,7±4,33 2,1±0,78 3-е 39,6±0,10 19,4±0,40 34,9±0,45 2,4±0,66 7-е 25,9±2,22 20,1±4,39 46,5±15,9 1,5±0,42 Группа сравнения (n=15) 1-е 28,3±7,86 19,3±1,65 33,5±3,13 2,2±0,64 3-е 22,9±1,30 16,5±0,85 28,6±1,25 2,3±1,04 7-е 23,7±2,49 18,0±0,23 29,2±1,57 2,5±0,25 Опытная группа (n=15) 1-е 25,4±1,89 18,7±3,13 32,7±1,25 2,7±0,41 3-е 26,7±2,75 15,0±0,51 27,7±2,57 3,1±0,29 7-е 29,9±2,40 16,8±1,82 30,2±1,92 2,7±0,24 Р <0,05 Сравнительная оценка гемостазиограмм контрольной, сравнительной и опытной групп позволила выявить гипокоагуляционную направленность изменений показателей гемостаза в целом у животных контрольной группы. В то же время в группах животных с применением «Фибриностата» и «Тиссукола» показатели второй фазы гемостаза практически находились в пределах условной физиологической нормы. 3. Влияние на белковый обмен, уровень трансаминаз и билирубина в опытах in vivo Белковый обмен. 5

6 Использование в качестве кровоостанавливающего сред-ства «Фибриностата» оказывало существенное влияние на ре-гистрируемые параметры протеинового обмена в сравнении с контрольной группой крыс (таблица 4). В контрольной группе животных уже спустя 24 часа после моделирования кровотечения происходило снижение содержания общего белка в плазме крови на 9,7% по сравнению с интактным контролем, и составило 65,33±1,713. На момент завершения наблюдений, к седьмым суткам содержание общего белка у крыс этой серии продолжало оставаться на 13,9 % ниже исходных значений. В опытной и сравнительной группах крыс применение «Фибриностата» оказывало позитивное влияние на развитие постгеморрагической гипопротеинемии. Незначительное уменьшение содержания общего белка по сравнению с животными интактного контроля отмечалось только в группе с применением тиссукола на первые. В остальные сроки наблюдения данный показатель был пределах физиологической нормы. Данные, по изучению содержания мочевины свидетельствуют о том, что в контрольной группе животных на первые после травмы происходило увеличение содержания мочевины в плазме крови на 19,1% по сравнению с интактным контролем. На момент завершения наблюдений, к седьмым суткам содержание ее увеличилось на 31,7 %. В опытной и сравнительной группах животных данный показатель повышался на первые и третьи, с последующим восстановлением к седьмым суткам практически до уровня нормальных значений. Эти результаты могут свидетельствовать о положительном влиянии изучаемого препарата на экскреторно-выделительную функцию почек и, косвенно, на сохранность детоксикационной функции печени Таблица 4. Динамика изменений белкового обмена Условия эксперимента 3-е 7-е Группы экспериментальных животных интактный контрольная группа контроль (n=5) группа (n=15) сравнения (n=15) Содержание общего белка (г/л) 1-е 71,97±1,881 Содержание альбумина (г/л) 1-е 6 опытная группа (n=15) 65,33±1,713 67,28±2,395 75,97±1,881 68,57±0,897 71,86±1,810 74,51±2,249 62,88±1,003 69,24±1,409 69,94±2,230 38,46±0,791 41,01±0,747 37,33±0,978 3-е 36,41±0,537 37,13±0,380 38,18±0,799 37,63±0,472 7-е 34,99±0,782 38,15±1,458 34,94±1,010 Содержание мочевины (ммоль/л) 1-е 3,52±0,234 4,35±0,732 5,59±0,836 4,58±0,099 3-е 5,83±0,635 3,57±0,190 5,45±,371

7 7-е 5,15±0,501 3,68±0,488 3,81±0,228 Р <0,05 Активность аминотрансфераз и уровень билирубина Протеолитические ферменты (АЛТ и АСТ) рассматриваются как патогенетические маркеры синдрома цитолиза, повышение которых в крови связанно с нарушением проницаемости мембран гепатоцитов или их гибелью и как следствие этого с тяжестью и распространенностью поражения печени. В контрольной группе животных наблюдался рост уровня общего билирубина с первых по седьмые, преимущественно за счет непрямой его фракции с одновременно возросшими в 2 раза цифрами АСТ и АЛТ на первые. Следует отметить, что к седьмым суткам уровень АСТ в крови крыс нормализовался, что свидетельствует о умеренно выраженном нарушении функции печени (таблица 5.). В группе сравнения, спустя 24 часа, так же отмечалось увеличение уровня билирубина и трансаминаз в 1,5-2 раза, одна-ко данные показатели уже на третьи были сопоставимы с уровнем интактного контроля. В опытной группе отмечено уве-личение уровня АЛТ на первые, с нормализацией к седь-мым суткам. Билирубин и АСТ не имели отклонений от физиоло-гической нормы. Таблица 5. Динамика изменений печеночных ферментов Условия Исследуемый показатель эксперимента Общий билирубин (мкмоль/л) Прямой билирубин (мкмоль/л) АСТ (Ед/л) АЛТ (Ед/л) интактный 12,05±0,776 1,65±0, ,2±9,24 37,1±4,85 контроль (n=5) Контрольная группа (n=15) 1-е 11, 03±0,623 6,82±2, ,0±60,18 81,7±6,64 3-е 14,00±0,941 3,05±0,689 80,3±29,95 66,0±7,37 7-е 15,31±1,286 1,88±0,565 96,5±13,58 80,81±1,80 Группа сравнения (n=15) 1-е 16,46±2,404 2,66±0, ,3±23,21 45,8±6,22 3-е 11,92±0,523 2,46±0,648 98,5±13,62 36,3±4,48 7-е 12,53±0,804 3,10±0, ,3±36,81 28,6±5,07 Опытная группа (n=15) 1-е 8,60±2,054 2,23±0, ,6±11,57 71,2±9,72 3-е 4,19±0,458 2,98±0, ,7±12,38 61,4±9,79 7-е 6,46±0,795 2,31±0,238 95,4±4,42 45,8±4,48 Р <0,05 Полученные результаты свидетельствуют о том, что обеспечение гемостаза как «Фибриностатом», так и «Тиссуколом», в условиях экспериментальной травмы печени препятствует генерализации нарушений функций печени и способствует репарации повреждённой ткани в ранний послеоперационный период. Выводы 7